Celem prowadzenia molekularnych badań genetycznych jest określenie obecności modyfikacji i zmian w niektórych chromosomach, regionach DNA lub genach. Ta metoda pracy z DNA była szeroko stosowana w praktyce w latach 70. i 80. XX wieku. ubiegłego wieku.
Kiedy odbywają się badania genetyczne molekularne
Badania genetyczne molekuł pomagają zdiagnozować:
- Monogeniczne choroby genetyczne;
- Prawdopodobieństwo wystąpienia chorób onkologicznych;
- Obecność czynników wywołujących choroby wieloczynnikowe.
Ustalenie ryzyka rozwoju procesów onkologicznych za pomocą badań genetycznych na poziomie molekularnym ujawnia:
- Ryzyko zachorowania na raka żołądka i tarczycy;
- Prawdopodobieństwo raka okrężnicy i wczesne stadium tej choroby;
- Genetyczne predyspozycje do rozwoju raka ciała macicy, jajników, gruczołów sutkowych i prostaty;
- Obecność rekombinacji genów ABL / BCR wykrytych w białaczce;
- Obecność warunków wstępnych zapewniających skuteczność terapii przeciwnowotworowej z gefatynibu w obecności niedrobnokomórkowego raka .
Przeprowadzając molekularne testy genetyczne na obecność genetycznie uwarunkowanych przesłanek rozwoju chorób wieloczynnikowych, można zidentyfikować ryzyko rozwoju:
- nadciśnienie;
- stan przedrzucawkowy;
- reumatoidalne zapalenie stawów;
- osteoporoza;
- zaburzenia metabolizmu lipidów;
- cukrzyca typu 1 i 2;
- choroby układu rozrodczego.
Za pomocą tej metody ocenia się metabolizm i zasadność stosowania niektórych leków..
Kto jest przepisywany badań genetycznych molekularnych
Molekularne testy genetyczne są pokazywane jednostkom:
- cierpiących na niepłodność;
- narażone na niekorzystne czynniki środowiskowe;
- posiadanie bliskich krewnych w rodzinie cierpiących na choroby onkologiczne, umysłowe, naczyniowe i wewnątrzwydzielnicze.
Jak wygląda molekularny test genetyczny
Pierwszy etap genetycznej analizy molekularnej jest bardzo ważny i polega na uzyskaniu próbek RNA i DNA, które są pojedynczymi fragmentami DNA komórki lub całego jej łańcucha. Aby wyizolować wymaganą liczbę fragmentów, stosuje się metodę amplifikacji, czyli ich rozmnażanie przez reakcję łańcuchową polimerazy (replikacja enzymatyczna).
Analiza cząsteczek DNA wymaga ich wstępnego podziału na części i leczenia endonukleazami bakteryjnymi (restrykcyjnymi) - enzymami, które mogą przeciąć podwójną helisę DNA na 4-6 par..
Fragmenty DNA rozdziela się pod względem długości i wielkości, stosując specjalny żel (poliakryloamid i agarozę), stosując elektroforezę. Pod działaniem tego ostatniego przemieszczają się w dół żelu z różnymi prędkościami, pozostawiając za sobą oddzielny pasek..
Molekularne badania genetyczne dziedzicznych patologii są również wykorzystywane do badania ludzkiego genomu. Hybrydyzacja typu Southerna umożliwia w tym przypadku określenie określonych fragmentów DNA niezbędnych do tego. Jednocześnie, w pierwszej kolejności uciekają się do denaturacji DNA, w wyniku czego fragmenty są otrzymywane w postaci pojedynczego łańcucha i przenoszone do filtra (nylon lub nitroceluloza), który jest moczony w roztworze buforowym.
Żel, na którym znajdują się fragmenty DNA, przenosi się na bibułę filtracyjną roztworem soli fizjologicznej (o wysokim stężeniu%). Filtr nitrocelulozowy i filtrowanie, ale suchy papier (do absorpcji roztworu soli) umieszcza się na wierzchu. W rezultacie jednoniciowy DNA pozostaje na filtrze w tej samej pozycji, co na żelu..
Aby zidentyfikować niezbędne fragmenty, przeprowadza się procedurę hybrydyzacji DNA z jego klonowanym fragmentem lub sondą radioaktywnego DNA. Wynik tej procedury jest wykrywany przez radioautografię, dzięki czemu wszystkie komplementarne sondy sekwencji DNA znajdują odzwierciedlenie w formie radioaktywnego pasma..
Metoda południowa pozwala odtworzyć mapę restrykcyjną ludzkiego genomu w pewnej części genu. Umożliwia to wykrycie obecności jakichkolwiek defektów w samym genie. Opracowane metody są uważane za dość skuteczne i pozwalają na najdokładniejsze rozpoznanie chorób dziedzicznych. W tym celu DNA ekstrahuje się z komórek embrionalnych zawartych w płynie owodniowym. Następnie hybrydyzuje się metodą Southern blot z sondą radioaktywnego DNA. W rezultacie bardzo łatwo rozpoznać nieprawidłowy embon, ponieważ jego DNA hybrydyzuje wyłącznie z sondą DNA, która jest komplementarna do zmutowanej sekwencji..
Współczesna nauka wykorzystuje wiele metod do identyfikacji mutacji. Wszystkie są podzielone na pośrednie i bezpośrednie molekularne metody badań genetycznych..
Pośrednie metody wykrywania mutacji są stosowane, gdy pozycja genu na mapie genetycznej jest znana, ale jego sekwencja nukleotydowa nie jest odszyfrowana..
Diagnoza bezpośrednia może być kilku rodzajów:
- Sekwencjonowanie. Jest to technika identyfikowania sekwencji nukleotydów w celu określenia zastępowania zasad w określonym fragmencie..
- Hybrydyzacja Blot, ale Southern. Jest to analiza restrykcyjna, dzięki której znajdują mutacje, które naruszają witrynę restymacji..
- Hybrydyzacja allelospecyficzna za pomocą sondy syntetycznej. Ta metoda pozwala również wykrywać mutacje w genomowym DNA..
- Elektroforeza dwuniciowego DNA w żelu (jednorodnie denaturujące, neutralne). Jest to cięcie DNA na poziomie chemicznym i enzymatycznym. W tych miejscach, gdzie bazy są źle zszyte, zwykle definiuje się grupę mutacji..
- Badanie ruchliwości elektroforetycznej zmutowanych cząsteczek DNA.
- Analiza syntetyzowanego białka za pomocą elektroforezy. Obecność mutacji ocenia się na podstawie zmiany mobilności białek w układzie in vitro.
Mutacje są również diagnozowane przy użyciu definicji fragmentów polimorficznych (długość restrykcyjna) w genomie. W tym celu stosuje się tę samą technikę hybrydyzacji typu Southerna..
Wśród innych typów polimorfizmu DNA wyróżniono także mikrosatelity. Są to krótkie sekwencje DNA (tandemowo powtarzające się mono-, di-, tri- i tetranukleotydowe). Służą one jako markery wadliwych mutacji lub markerów loci allelicznych wariantów genu w badaniu..
Gen odpowiedzialny za rozwój pląsawicy Huntingtona, poważną patologię, odkryto w 1993 r. Wraz z tą chorobą następuje spadek rozwoju intelektualnego, zaburzenia ruchomości CNS u ludzi po 40 latach. Choroba jest dziedziczna i jest przenoszona przez autosomalny dominujący typ, ma 100% penetrance. Gen choroby znajduje się na czwartym chromosomie, w krótkim ramieniu.
Ten gen obejmuje sekwencję nukleotydową w postaci wielokrotnych powtórzeń nukleotydu CAG. U zdrowych ludzi takie powtórzenia zwykle wynoszą 11-34, pacjenci z pląsawicą mają 37-86, ale zwykle 45. Z tego wynika, że pląsawica Huntingtona jest dziedziczną patologią z mutacją genową w wielokrotnym zwiększaniu liczby kopii (ekspansja).
Julia Viktorova, ginekolog-położnik