Diagnostyka preimplantacyjna (PGD) chorób dziedzicznych i zarodków / Reproduktologia

Testy genetyczne to metoda stosowana do diagnozowania wad dziedzicznych w zarodkach uzyskanych w wyniku zapłodnienia in vitro przed zajściem w ciążę. Diagnostyka przedimplantacyjna (PGD) jest alternatywą dla amniopunkcji i biopsji kosmków kosmówki, po której często następują trudne decyzje o przerwaniu ciąży, jeśli wyniki są niekorzystne.. Dzisiaj PGD jest jedyną możliwą opcją uniknięcia wysokiego ryzyka posiadania dziecka z chorobami genetycznymi..

W jakich przypadkach PGD jest wykonywane w przypadku patologii genetycznych

Wskazania do diagnostyki preimplantacyjnej według genetyki:
Nośnik autosomalnych chorób recesywnych;
Patologia związana z chromosomem X;
Pary ze znaczącymi translokacjami chromosomowymi, które zakłócają implantację, prowokują poronienia lub implikują problemy psychiczne lub fizyczne u potomstwa;
Nośnik autosomalnych dominujących chorób.

Diagnostyka przedimplantacyjna jest stosowana w przypadku patologii związanych z płcią, defektów pojedynczych genów i zaburzeń chromosomowych..

Nadużycia seksualne

Choroby związane z X są przekazywane dziecku przez matkę, która jest nosicielem. Patologiczny chromosom X powoduje chorobę u synów, którzy nie dziedziczą prawidłowego chromosomu X od ojca, ale otrzymują chromosom Y. W przyszłości oczekuje się narodzin zdrowych chłopców, ale prawdopodobieństwo przewozu córek wynosi 50%, pod warunkiem, że zdrowie matki.

Jest ważny

Choroby związane z chromosomem X nigdy nie są przenoszone z ojca na syna.

Autosomalna recesywna patologia obejmuje hemofilię, większość dystrofii nerwowo-mięśniowych i setki innych chorób..

Autosomalne zaburzenia dominujące przejawiają się jako zespół Retta, pseudo-nadczynność przytarczyc, krzywica oporna na witaminę D, zespół Bloch-Sulzbergera (dziedziczna choroba pigmentacji skóry z patologią aparatu wzrokowego, zębów i ośrodkowego układu nerwowego), itp..

Chromosom Y niesie znaczącą liczbę genów, ale powiązane są z tym niektóre patologie różnicowania płciowego..

W ciężkich postaciach upośledzonej spermatogenezy (krytycznie mała liczba lub całkowita nieobecność męskich komórek rozrodczych) w 18% przypadków zdiagnozowano mikrodelecje w genie czynnika azoospermii zlokalizowanego na długim ramieniu chromosomu U.

Wady pojedynczego genu

PGD służy do identyfikacji indywidualnych wad genetycznych, które powodują wiele chorób:

Mukowiscydoza;
Tajska choroba Sachs;
Niedokrwistość sierpowata;
Choroba Huntingtona.

Dzięki tym patologiom diagnostyka genetyczna wykrywa defekt przy użyciu metod molekularnych wykorzystujących amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (wielokrotna replikacja) DNA z pojedynczej komórki.

Zaburzenia chromosomalne

Translokacja, inwersja i delecja powodują uszkodzenie chromosomu, który można wykryć przy użyciu hybrydyzacji fluorescencyjnej. Dla niektórych par szanse na przetrwanie ciąży bez PGD są znikome, ponieważ wcześniejsze próby doprowadziły do pojawienia się zarodków z mutacją chromosomową i zakończyły się spontanicznymi poronieniami.

Wstępne wszczepienie genetyczne: wskazania względne

Według badań, większość wczesnych aborcji ciąży jest spowodowana aneuploidią, naruszeniem liczby chromosomów. Ponieważ zdrowe zarodki są przenoszone do macicy, prawdopodobieństwo poronienia w pierwszym i drugim trymestrze maleje.

Obecnie nie ma szczegółowej listy wskazań do PGD.

Wstępne wszczepienie genetyczne jest uważane za pożądane w następujących przypadkach:

Planowana ciąża u starszej kobiety.
Obciążona historia położnictwa i ginekologii z powtarzającymi się poronieniami.
Nieudane wielokrotne próby zapłodnienia in vitro, w tym metoda ICSI.
Ciężki męski czynnik niepłodności.

Udowodniony fakt, że ryzyko aneuploidii wzrasta wraz z wiekiem. Chromosomy mają mniejsze prawdopodobieństwo prawidłowego podziału, co skutkuje dodatkowym lub brakiem chromosomu w zarodku. Patologiczna liczba chromosomów jest większa niż 20% w przypadku matek w wieku 35-39 lat, a w wieku 40 lat i starszych osiąga 40%.

Częstość występowania aneuploidii u dzieci urodzonych przez matki w wieku 35-39 lat - 0,6-1,4%, powyżej 39 lat - 1,6-10%.

Jest ważny

Nie wszystkie ciąże kończą się urodzeniem zdolnego do życia dziecka, czasami dochodzi do samookaleczenia, zanim kobieta podejrzewa o jej stan..

Przykładem częstej aneuploidii jest trisomia 21 chromosomu, co prowadzi do zespołu Downa. Częstotliwość trisomii 21 w płodnym płodzie oceniano w zależności od wieku matki. Zgodnie z wynikami, optymalny wiek do porodu to wiek 20-24 lata (najniższe ryzyko to 1/1400). W wieku 40 - 1/100, powyżej 45 lat - 1/25.

Powtarzające się poronienia i diagnoza PGD

Jeśli kobieta ma 2 lub więcej następujących po sobie przerw w ciąży do 20 tygodni, PGD jest uzasadnione przed zapłodnieniem in vitro. Przyczyna jest często nieznana, ale nieprawidłowości chromosomalne w poronionych zarodkach są rozpoznawane w 50-80%.

Zwróć uwagę

Badania wykazały, że pary z wieloma poronieniami podlegają wyższemu odsetkowi aneuploidalnych zarodków..

Niepowodzenie IVF kilka razy z rzędu

Trzy lub więcej nieudanych prób IVF z udziałem zarodków o wysokiej jakości może wskazywać na nieprawidłowości chromosomalne. Ponadto warto pamiętać o czynnikach immunologicznych i macicznych, które przyczyniają się do upośledzonej implantacji..

Męski czynnik niepłodności

Męski hipogonadyzm prowadzi do tworzenia się zarodków z nieprawidłowościami chromosomowymi. W normalnym nasieniu występuje około 3-8% chorych plemników. Ich liczba znacząco wzrasta u mężczyzn z ciężką niepłodnością (zmniejszenie ilości, słaba morfologia i upośledzona aktywność motoryczna) do 27-74%.

Stosując śródplazmatyczną iniekcję plemników do komórki jajowej, zła jakość plemników nie jest już przeszkodą dla koncepcji biologicznie rodzimego dziecka. Stwierdzono, że różne wady genetyczne są związane z męskim czynnikiem niepłodności. Częściej obejmują one aneuploidię, zespół Klinefeltera, mikrodelecację chromosomu Y, uszkodzenie receptora androgenowego i inne autosomalne mutacje genów (mukowiscydoza).

Jest ważny

Podczas procedury ICSI selekcja naturalna jest wyłączona, więc wzrasta ryzyko przeniesienia mutacji genetycznych na potomstwo.

Wybór płci

PGD może określić płeć embrionu, ale chęć urodzenia chłopca lub dziewczynki bez dowodów (choroby genetyczne związane z płcią) nie jest etyczna.

Zgodność z ludzkim antygenem leukocytowym (HLA)

Wśród nowych wskazań PGD jest porównanie HLA. Ta metoda może być stosowana do wykluczenia patologii genetycznej. W sytuacjach, w których rodzina ma już dziecko z chorobą recesywną, konieczne jest leczenie przeszczepem komórek macierzystych lub szpiku kostnego (talasemia, białaczka), Możliwe jest wybranie "odpowiedniego" zarodka, który po urodzeniu stanie się dawcą dla probanda (brata lub siostry). Pierwszy przypadek opisano na przykładzie rodziny z dzieckiem cierpiącym na niedokrwistość Fanconiego, a PGD wykonano w celu wybrania zdrowego zarodka z tym samym rodzajem HLA, co chory brat. Wykorzystanie PGD w takich sytuacjach jest dyskusyjne z powodów moralnych i etycznych..

Diagnostyka przedimplantacyjna: jak to się robi i jakie są sposoby

Pary w strefie ryzyka są konsultowane przez genetyka, który ocenia ryzyko przeniesienia patologii genetycznej. Przeprowadzaj testy potwierdzające diagnozę jednego z rodziców. W zależności od choroby genetycznej wybiera się metodę diagnostyczną, za pomocą której można zidentyfikować zmiany w zarodku..

Aby uzyskać biomateriał do PGD, stosuje się tylko IVF.. W trzecim lub piątym dniu po zapłodnieniu ekstrahuje się wymagany biomateriał. Analiza genetyczna przed przeszczepieniem jest przeprowadzana przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), hybrydyzacji fluorescencyjnej (FISH), porównawczej hybrydyzacji genomowej (CGH) i testowania NGS.

Zdrowe zarodki są przenoszone do macicy (z reguły nie więcej niż 2), podczas gdy reszta jest zeszklona. Szybkie zamrażanie pozwala na ich użycie w następujących cyklach IVF.

PCR

PCR służy do diagnozowania defektów pojedynczych genów, w tym zaburzeń dominujących i recesywnych.. PCR (czasami nazywana amplifikacją DNA) to metoda, w której określona sekwencja jest kopiowana wiele razy, co pozwala na analizę.

Aby uzyskać dokładną diagnozę, potrzebujesz wysokiej jakości próbkę DNA, która jest trudna do uzyskania z pojedynczej komórki..

Błędy w analizie PCR mogą prowadzić do przeniesienia zarodka o złej jakości do 11% w autosomalnie dominującej patologii i 2% do recesywnego.

Reakcja łańcuchowa polimerazy pozwala określić diagnozę, jeśli występuje:

Wady pojedynczego genu w chorobie autosomalnej;
Patologia pojedynczego genu w niepłodności męskiej;
Identyfikacja płci w przypadku chorób związanych z X..

Fluorescencyjna hybrydyzacja (FISH)

FISH służy do określania płci w przypadku chorób związanych z chromosomem X, nieprawidłowości chromosomów i aneuploidii.

Sondy reprezentujące małe fragmenty DNA odpowiadające analizowanym chromosomom wiążą się z "ich" chromosomem. Każda sonda ma swój własny barwnik. Proces wizualizowany jest pod mikroskopem fluorescencyjnym. Liczba chromosomów każdego koloru jest zliczana i wyciągane są wnioski..

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ jest uzasadniona, jeśli jest to konieczne do wykonania:

Badanie anneuploidalne u kobiet w wieku powyżej 38-39 lat;
Liczenie liczby chromosomów w niepłodności męskiej;
Identyfikacja płci w chorobach związanych z X;
Diagnoza translokacji rodziców, która doprowadziła do wielokrotnych poronień.

Porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH, SHG)

Ludzka komórka zawiera 23 pary chromosomów; jednak analiza FISH umożliwia dokładną ocenę tylko 7-9 chromosomów w każdej otrzymanej komórce. W konsekwencji wiele nienormalnych zarodków pozostaje niewykrytych i może być użyte w transferze.

Podczas przeprowadzania porównawczej hybrydyzacji genomowej testowany DNA traktuje się barwnikiem fluorescencyjnym (zielony), a czerwony stosuje się do próbki. Następnie dwie komórki hybrydyzują, a stosunek między dwoma kolorami jest porównywany. Jeśli analiza chromosomów wykazuje nadmiar czerwieni, jądro embrionalne zawiera dodatkowy chromosom. Jeśli występuje nadmiar koloru zielonego, brakuje jednego z chromosomów w jądrze zarodka.. SHS umożliwia nie tylko ocenę wszystkich 23 chromosomów, ale także daje bardziej szczegółowy obraz długości, który może wykryć nierównowagę segmentów chromosomowych..

Ta metoda trwa obecnie 72 godziny. Biorąc pod uwagę ograniczoną długość życia zarodków w pożywce hodowlanej, konieczna jest witryfikacja zarodków. Nawet przy wysokiej przeżywalności kriokonserwacja może prowadzić do 30% utraty żywotnych zarodków..

Zwróć uwagę

W dużych klinikach rozrodczych pracują już nad przyspieszonymi protokołami SHG, w których wynik staje się znany po 24 godzinach, co pozwala nie przegapić optymalnego czasu na transfer.

Testowanie NGS

Metoda obejmuje oznaczenie sekwencji nukleotydów (podstawowe struktury materiału dziedzicznego) w RNA i DNA.

Korzyści obejmują:

umiejętność oceny użyteczności / wad wszystkich chromosomów;
minimalizacja błędów spowodowanych automatyzacją procesów;
jednoczesne dekodowanie wielu sekwencji;
wielokrotna analiza locus kodu genetycznego;
wysoka czułość i dokładność;
minimalizacja błędnego wniosku (0,001%);
atraumatyczne dla zarodka;
zwiększyć szanse na pomyślne zapłodnienie in vitro.

Bezwzględne wskazania do NGS: przenoszenie nieprawidłowości chromosomowych u rodziców lub rodzaju, choroby genetyczne związane z płcią.

Badanie przedimplantacyjne NGS obejmuje następujące kroki:

biopsja zarodka w stadium blastocysty, częściej biopsja trophoktodermy;
izolacja cząsteczek kwasu nukleinowego;
tworząc podstawę dla kolejnych testów genetycznych,
amplifikacja w celu otrzymania amplikonów metodą PCR, które przyjmuje się jako próbkę;
skomputeryzowana wizualizacja podstawowego modelu DNA / RNA w wyniku wielokrotnej, nierównoległej analizy fragmentów.

Specjalista ocenia na grafice komputerowej, która pokazuje patologię w postaci spadków lub szczytów.

Na podstawie testów NGS, embriony o niskiej witalności lub z klinicznie wyraźnymi mutacjami są odrzucane, a pozostałe po rozmrożeniu są używane w protokołach IVF.

Nie wszystkie kliniki reprodukcyjne przeprowadzają tę analizę..

Jest ważny

Diagnostyka przedimplantacyjna nie znajduje się na liście świadczeń obowiązkowego ubezpieczenia zdrowotnego i jest opłacana przez pacjenta.

Co jest badane z PGD

Większość klinik przeprowadza biopsję zarodków na etapie cięcia, ale jedną z 3 metod można zastosować w przypadku PGD.

Biopsja ciała polarnego

Metoda jest odpowiednia do wykrywania patologii genetycznej u kobiety, ponieważ szacuje się liczbę chromosomów w komórce jajowej. Biopsja ciała polarnego nie pozwala na uzyskanie informacji o strukturze chromosomowej przyszłego zarodka, ponieważ otrzyma on drugą połowę materiału genetycznego od ojca. Ta metoda jest rzadko używana..

Biopsja zarodków z hetchowaniem

Najczęstszą metodą PGD jest badanie pojedynczego blastomeru uzyskanego z rozwijającego się zarodka trzeciego dnia. Zabranie blastomeru jest technicznie trudnym zabiegiem, odbywa się za pomocą specjalnego mikroskopu i mikromanipulatorów. Cel - usunięcie pożądanych komórek z minimalnym urazem do zarodka.

W 3 dniu rozwoju zarodek składa się z 6-10 komórek, a przed manipulacją jest przechowywany w specjalnym środowisku przez 20 minut, aby zmniejszyć sklejanie blastomerów. Następnie zarodek zostaje unieruchomiony i powstaje w nim dziura, która otwiera dostęp do blastomerów. Ta procedura nazywa się "wylęganiem" i może być przeprowadzona przy użyciu roztworu kwasu, lasera lub mechanicznie. Do otworu wprowadzana jest pipeta, która koncentruje się na wybranym blastomerze z widocznym jądrem. Poprzez aspirację blastomer jest ekstrahowany i przetwarzany do FISH lub do PCR (diagnostyka PCR), w zależności od genetycznej patologii. Zarodek zanurza się w odpowiedniej pożywce hodowlanej..

Wady metody obejmują fakt, że zarodek może być mozaiką, a dla analizy genetycznej istnieje prawdopodobieństwo usunięcia "zdrowego" blastomeru..

Biopsja blastocysty

Tworzenie blastocysty rozpoczyna się w piątym dniu i jest określane przez nagromadzenie wewnętrznej i zewnętrznej masy komórek. Na tym etapie zarodek składa się z około 100 komórek. Przez dziurę komórki są pobierane z trophoektodermu za pomocą cienkiej pipety do biopsji. Wewnętrzna masa komórek nie jest uszkodzona. Analizę genetyczną przeprowadza się za pomocą FISH lub PCR.

Ograniczenie procedury diagnostycznej - mozaika zarodka i wymagany czas na badanie - 24-48 godzin, co znacznie zmniejsza żywotność i zakłóca implantację.

Jedynym wyjściem jest zamrożenie biomateriału, po którym jakość zarodków jest nieznaczna.

PGD w większości przypadków jest zakończona w ciągu 24 godzin po wykonaniu biopsji, co pozwala wykonać transfer w dniu 4 lub 5.

Zwróć uwagę

Większość klinik analizuje 24 chromosomy (22 autosomy i 2 chromosomy płci), stosując porównawczą hybrydyzację genomową na embrionie osiągającym 5 dni..

Plusy i minusy analizy genetycznej w zarodkach 3-dniowych i 5-dniowych

Trzy dni:

większe ryzyko obrażeń (około 15%, ważną rolę, jaką odgrywa kwalifikacja embriologa);
zdolność do analizy tylko 9 chromosomów, w tym tylko najczęstszych chorób dziedzicznych;
prawdopodobieństwo biochemicznej i nieodebranej aborcji z powodu patologii w nieodkrytych chromosomach;
mozaikowość.

Pięć dni:

żywotność zarodków zmniejsza się, ponieważ istnieją poza ciałem matki, należy poczekać na biopsję (możliwe jest poddanie wczesnego blastocysty witryfikacji lub przeniesieniu);
powstrzymanie rozwoju "dobrych" embrionów niezwiązanych z czynnikami genetycznymi;
możliwość przeprowadzenia kompleksowej analizy chromosomalnej;
niskie ryzyko uszkodzenia zarodka (około 5%).

Jest ważny

Niska jakość zarodków jest odrzucana, jeżeli nastąpiło przeniesienie, ciąża nie wystąpiła lub zakończyła się rozwój lub przerwa w działaniu we wczesnych stadiach.

Jaki jest najlepszy sposób na PGD

Eksperci uważają, że porównawcza hybrydyzacja genomowa jest lepsza niż

Diagnostyka FISH, ponieważ możliwości tej metody są szersze, a ryzyko zranienia zarodka jest mniejsze. Ze szczególnymi cechami kariotypu rodzica (na przykład translokacja) istnieje możliwość wystąpienia efektu interchromosomalnego - ryzyko nieprawidłowej dywergencji dowolnych chromosomów, a nie tylko tych uszkodzonych i zdiagnozowanych podczas kariotypowania u matki lub ojca.

Wady obejmują potrzebę kriokonserwacji i wysokie koszty.

Badanie FISH jest lepsze od PCR, ponieważ reakcja polimerazy niesie ryzyko błędnej diagnozy z powodu zanieczyszczenia biologicznego..

Dzisiaj najskuteczniejsza metoda - NGS - sekwencjonowanie nowej generacji.

Mishina Victoria, urolog, recenzent medyczny